O método de coloração de Gram foi desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884 e é um dos métodos mais usados nos laboratórios de microbiologia e análises clínicas. Com esse método é possível diferenciar bactérias pelas diferenças nas estruturas das paredes celulares.
O esfregaço bacteriano fixado pelo calor passa por sucessivos tratamentos com agentes químicos específicos e desta forma as bactérias adquirem coloração azul ou vermelha, de acordo com a capacidade da parede celular de cada bactéria reter o corante.
As bactérias azuis são as que retem o corante cristal violeta (corante primário) no citoplasma após o tratamento com etanol-acetona e são chamadas de gram-positivas. Já as vermelhas não têm a capacidade de reter o corante cristal violeta e ao final incorporam o corante fucsina básica, que lhes dá uma coloração vermelha e são chamadas de gram-negativas.
Fig 1: Exemplo coloração de Gram
A coloração de Gram é sempre o primeiro passo para caracterização de uma amostra biológica que contém bactérias. A técnica tem grande importância clínica, pois muitas vezes as bactérias associadas à infecção podem ser caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas diretamente em esfregaços de secreções ou outros fluidos biológicos, auxiliando o clínico no monitoramento da infecção enquanto que a identificação da cultura bacteriana seja concluída por outros métodos.
Procedimento do método
- Confeccionar o esfregaço, a partir de material biológico ou cultura bactéria em meio sólido ou líquido, em lâmina de vidro
- Fixar pelo calor
- Corar com cristal de violeta (corante primário) por 60 segundos;
- Lavar com água destilada;
- Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol (agente fixador) por 60 segundos;
- Lavar com água destilada;
- Descorar com álcool a 95%, ou etanol-acetona (1:1; v:v) por 10-20 segundos (dissolução da parede lipídica);
- Lavar com água destilada;
- Corar com fucsina (corante secundário) por 20 segundos
- Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio óptico.
NOTAS:
- É possível a análise de vários esfregaços numa mesma lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos.
- As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.
